J Exp Med：烟酰胺单核苷酸核糖（NNT）通过维持Fe-S蛋白功能而调节NSCLC线粒体代谢

生物肾炎表现显露极强大而复杂的真核细胞可能会人体内，也许是由肾的组织的高磷持续性造成的。由于活持续性磷(ROS)的分解是这种人体内的副有机体，因此须要要以烟乙吡啶N-二核苷醛磷醛(NADPH)的基本上来增加磷化物应将激，以应将对这种真核细胞可能会活持续性的增极强。烟乙吡啶单核苷醛转移酵素(NNT)可通过NADPH的分解来延续真核细胞可能会的抗菌战斗能力，但其在非小细胞可能会肾炎(NSCLC)当中的更为重要作用即已指明。本研究工作推测NNT的表达显露来在肾炎活体基本概念当中突显露增极强了的转变成和来袭持续性。另除此以外，更进一步研究工作推测NNT缺少可能会加剧真核细胞可能会机能障碍，这与磷化物应将激的大量减低就其，而是以NADH蛋白质的活持续性增加为标志。这些却是与NADPH的有效持续性和ROS的造就有关，这确实NNT在减低这些更为重要蛋白质辅因子的磷化物当中起着更为重要更为重要作用。

测试设计

许多少用的肾炎活体基本概念是依靠C57BL6/J活体的家养思路而建立。引人入胜的是，这些活体运载纯合遗传物质7-11的框内缺少以及真核细胞可能会当中Nnt基因序列的错义基因加剧非机能蛋白质的表达显露来。因此，可以依靠这种自然缺少的等位基因(NntΔex7-11)来评价NNT对肾炎愈演愈烈的不良影响。

首先，使用Kras基因(LSL-KrasG12D/+)引致的肾炎基本概念来侦测Nnt表达显露来对肾炎愈演愈烈的不良影响。运载Cre分拆酵素的腺病毒病菌LSL-KrasG12D/+活体，可诱发KrasG12D在肾表皮当中的表达显露来和肾腺癌的转变成。依靠LSL-KrasG12D/+活体和C57BL6/J活体交配导致Nnt+/+表达显露来活体或NntΔex7-11/Δex7-11表达显露来活体(示意图1A-1B)。该基本概念当中Nnt的表达显露来加剧Cre分拆酵素诱发的超载加快3个年底(示意图1C-1D)。然后，依靠Kras基因与p53缺少同时表达显露来(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也称为KP)建立肾炎基本概念。Nnt的表达显露来未改变Cre诱发的KP活体的存活率(示意图1E)。引人入胜的是，在这个基本概念当中，p53的缺少消除了Nnt表达显露来对肾炎转变成的不良影响，并且无论Nnt表达显露来如何，测试最终都存在突显露的超载(示意图1F)。肾炎超载数目的量化在相同遗传活体两者之间未相似之处(示意图1G-1H)。

虽然相同遗传活体两者之间的超载未相似之处，但确实通过观察到基本概念当中来袭持续性的相似之处。我们推测Nnt+/+活体当中51.3%的为3级(腺癌)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11活体当中仅有36.5%和38.8%的是高级(示意图1I)。Nnt+/+活体愈演愈烈4级的高频率特别是在减低，不可否认来袭持续性的推移(示意图1J)。总之，这些统计数据确实Nnt有利于了肾炎的愈演愈烈和来袭。

2 NNT的缺少不不良影响真核细胞可能会当中硫磷还蛋白质(TXN)的抗菌基础

为了更进一步评量NNT对肾炎生物学的不良影响，首先评量shRNA分心NNT蛋白质的表达显露来，包括4个表达显露来NNT蛋白质的NSCLC细胞可能会系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不表达显露来NNT蛋白质的H441细胞可能会(示意图2A)。分心NNT蛋白质表达显露来抑制NSCLC细胞可能会的增生战斗能力(示意图2B)。并且推测比较慢病毒病菌4天后NNT的持续上升增加了H2009和PC9细胞可能会的生存战斗能力(示意图2C)。此除此以外，H441细胞可能会的增生受NNT的不良影响。

通常相信NNT最大限度NADPH的氢化战斗能力，从而延续真核细胞可能会蛋白质抗菌系统设计受制于氢化长时间(示意图2D)。分心NNT增加了H1299、H2009和PC9细胞可能会当中NADPH: NADP+的数目 (示意图2E)。比较慢病毒病菌4天后真核细胞可能会当中H2O2特别是在减低(示意图2F)，所以NNT对H2O2利尿流程很极其重要。

为了断定这些真核细胞可能会ROS的减低确实与真核细胞可能会抗菌系统设计有关，于是依靠Western blotting评量真核细胞可能会当中过磷化物物蛋白质3(PRDX3)的磷化物长时间。H2O2通过PRDX3利尿，即一对半胱氨醛交联诱发PRDX3转变成阴离子，并且不能通过TXN氢化这些半胱氨醛交联才能氢化PRDX3的抗菌机能。PRDX3阴离子的造就是PRDX3磷化物的标志，是真核细胞可能会磷化物应将激的常用标志物。

奥拉诺芬是一种TXN氢化酵素(TRXR)肽，虽然奥拉诺芬的病人可能会加剧PRDX3蛋白质大量磷化物，但NNT的缺少并未减低PRDX3的磷化物(示意图2G)。此除此以外，NNT的缺少也未增加真核细胞可能会TXN2或TRXR2的蛋白质素质。总之，这些结果确实NNT在NSCLC细胞可能会增生战斗能力上造就极其重要更为重要作用，但NNT活持续性的丧失这不能损伤真核细胞可能会TXN抗菌系统设计，也不能引致突显露的磷化物应将激。

3 NNT的缺少可能会损伤真核细胞可能会的磷化物战斗能力

鉴于NNT在IMM当中的定位及其不良影响膜上氢原子总能量和氢化战斗能力，于是试示意图探讨NNT对真核细胞可能会磷化物人体内确实极其重要。首先，使用鲎细胞可能会除此以外总能量系统性仪同步进行真核细胞可能会冲击次测试，评量NNT缺少对一般真核细胞可能会磷化物机能的不良影响。结果推测NNT缺少细胞可能会的耗磷量(OCR) 随真核细胞可能会肽的依次传递而被减低(示意图3A)。值得注意的是，NNT缺少细胞可能会的最大颤动战斗能力在不发挥作用非电磁场颤动的只能特别是在增加(示意图3B)。这提示真核细胞可能会磷化物却是与NNT对氢原子局部的不良影响就其。鉴于NNT缺少突显露不良影响颤动战斗能力，于是侦测NNT缺少的H441细胞可能会确实比NNT表达显露来细胞可能会具有相对于来说的磷化物和愈来愈极强的糖酵解战斗能力。这指明这些细胞可能会在未NNT的只能也许通过真核细胞可能会NADPH来源而延续真核细胞可能会的机能。

真核细胞可能会的磷化物人体内发挥作用ETC的机能，ETC由抑制电子传递的Fe-S蛋白质亚基分成。难以实现Fe-S蛋白质亚基的生物氢化流程须要要NADPH，于是研究工作NNT分心后真核细胞可能会颤动机能的上升确实与Fe-S蛋白质就其。真核细胞可能会冲击次测试可以对颤动机能同步进行一般持续性的系统性，但不可以对单个ETC亚基含有同步进行评量。因此，译者同步进行了愈来愈为大学本科的测试来系统性Fe-S蛋白质依赖的颤动就其亚基(I, II, III)。结果推测，基于亚基I(醛和苹果醛)的排泄，在NNT分心后亚基I-III的活持续性特别是在增加(示意图3C)。此除此以外，NNT却是细胞可能会突显露增加了珍珠醛的OCR，确实增加了珍珠醛脱氢酵素(SDH)活持续性和亚基II-III流量(示意图3D)。加剧这一现象的极其重要诱因是SDH在ETC和TCA反应将器当中扮演着双重角色。

除了通过ETC延续震荡量除此以外，Fe-S蛋白质还延续对磷化物人体内至关极其重要的其他蛋白质酵素的机能。为了断定NNT确实参与其他Fe-S蛋白质的机能，译者评量了TCA反应将器当中Fe-S蛋白质——顺乌头醛酵素(ACO2)的活持续性。结果推测分心NNT特别是在增加了NSCLC细胞可能会系当中ACO2的活持续性(示意图3E)。ACO2活持续性的增加也许可能会毁坏TCA反应将器，进而减低驱动ETC流量的氢化持续性物质的分解。为了多余非小细胞可能会肾炎当中ACO2机能的系统性，于是评价Nnt表达显露来对KP肾炎当中ACO2活持续性的不良影响。结果确实，Nnt+/+活体当中Aco2活持续性突显露大于NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11当中的，发挥作用Nnt的表现显露最低的活持续性(示意图3F)。

4 除此以外源持续性NADPH在NNT缺少后延续Fe-S蛋白质机能

为了断定与分心NNT就其的真核细胞可能会Fe-S蛋白质机能的增加确实与NADPH:NADP+的增加有关，我们试示意图提供一种真核细胞可能会NADPH的除此以外源持续性来源。为了实现这一目标，我们可选择了发酵真核细胞可能会当中NADH激酵素pos5p，它可以磷醛化NADH而导致NADPH。虽然pos5p以前在微生物当中也有除此以外源表达显露来，但据我们津津乐道，pos5p还未被引入哺乳动物系统设计。为了侦测我们确实能够有效地在生物NSCLC细胞可能会的真核细胞可能会当中表达显露来pos5p蛋白质，我们对发酵蛋白质同步进行了省略，使其包含HA-tag。Western blot近期，在H1299、H2009和PC9细胞可能会的真核细胞可能会当中成功表达显露来了HA-tag标记的pos5p蛋白质(示意图4A)。可选择这些细胞可能会系是为了评量pos5p修复和NNT缺少就其的Fe-S蛋白质却是的战斗能力，推测分心NNT后对它们造成很轻微的不良影响。

pos5p的表达显露来扭转了细胞可能会当中分心NNT后引致的NADPH: NADP+数目的减低(示意图4B)。这与表达显露来pos5p细胞可能会当中pos5p扰后颤动碱基复杂大型活动的减低有关(示意图4C和4D)。此除此以外，pos5p的表达显露来完全扭转了NNT分心后ACO2活持续性的上升(示意图4E)。总之，这些统计数据确实延续NNT表达显露来缺少时NADPH的素质可以保护NSCLC细胞可能会当中Fe-S蛋白质的机能。

5 NNT的缺少不能毁坏Fe-S蛋白质的生物氢化

难以实现真核细胞可能会除此以外源持续性NADPH能够弱化NNT缺少就其Fe-S蛋白质的却是，并且NADPH是高效延续Fe-S蛋白质生物氢化的必备条件，因此我们接下来试示意图断定NNT活持续性确实延续这一流程。Fe-S蛋白质生物氢化愈演愈烈在一个由半胱氨醛烟气酵素(NFS1)和Fe-S底座蛋白质(ISCU)分成的多蛋白质亚基当中。亚基当中任何一种含有的缺少均可能会不良影响生物氢化，并且也与真核细胞可能会却是就其。因此，我们分心NFS1或ISCU表达显露来来研究工作毁坏Fe-S蛋白质生物氢化后对颤动碱基和ACO2的不良影响。

在H2009细胞可能会当中，分心NFS1后特别是在增加醛/苹果醛加成和珍珠醛加成当中颤动碱基亚基I-III的活持续性，而在PC9细胞可能会当中只有亚基II-III活持续性被突显露增加(示意图5A和5B)。另除此以外，两个细胞可能会系当中，在醛/苹果醛和珍珠醛的更为重要作用下，分心ISCU表达显露来后特别是在弱化了OCR(示意图5A和5B)。并且分心NFS1或ISCU后特别是在增加了细胞可能会系当中ACO2活持续性(示意图5C)。引人入胜的是，NNT分心后所引致的却是与Fe-S蛋白质生物氢化所须要物质造成的却是是同等极其重要的(示意图5A-5C)。

为了证明Fe-S蛋白质却是对NSCLC细胞可能会的真核细胞可能会人体内有机能持续性不良影响，我们对分心NNT或ISCU细胞可能会同步进行基于色谱法色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)的人体内组学研究工作。 对这些细胞可能会TCA反应将器的人体内物同步进行系统性，近期大多数当中间有机体的丰度愈演愈烈了特别是在推移(示意图5D)。这些都确实了磷化物人体内的轻微毁坏和Fe-S蛋白质机能却是的一致持续性。具体地说就是分心NNT和ISCU表达显露来后，醛、苹果醛和富马醛被耗用。NNT缺少细胞可能会当中的柠檬醛素质被耗尽，但分心ISCU细胞可能会当中并未此结果。另除此以外，分心ISCU细胞可能会当中珍珠醛大量造就，而在NNT缺少细胞可能会当中则不存在此现象(示意图5D)。

除了Fe-S蛋白质ACO2和SDH除此以外，TCA反应将器还发挥作用另一种真核细胞可能会Fe-S蛋白质——硫辛醛氢化酵素(LIAS)的机能。LIAS对于硫辛醛的氢化以及极其重要硫辛醛水碳原子的等价都极为更为重要，硫辛醛水碳原子由PDH (E2)和α-酮戊二醛脱氢酵素(二氢硫辛乙吡啶S-珍珠吡啶转移酵素，DLST)分成。LIAS对Fe-S蛋白质生物氢化的毁坏特别引人注意，因为其Fe-S簇在氢化流程当中被耗用掉，这就允许不断地同步进行蛋白质反之亦然。事实上，分心NFS1和ISCU表达显露来可能会大量减低PC9细胞可能会当中PDH-E2和DLST的脂化，然而分心NNT对蛋白质脂化无不良影响(示意图5E)。总的来说，这些统计数据确实，NNT引发酵素和人体内却是，它们的却是与Fe-S蛋白质生物氢化的毁坏就其，但NNT不也许直接不良影响这一流程。这反映显露分心NNT和ISCU后对TCA反应将器导致类似但又相同的不良影响。

6 NNT的缺少毁坏糖类人体内

除了耗用TCA反应将器除此以外，NNT却是细胞可能会的LC-HRMS人体内组学系统性确实糖类人体内失调。分心NNT有利于长碱基饲料氨基单糖的大量造就，而长碱基饲料氨基单糖是糖类β-磷化物的底物(示意图6A)。鉴于在NNT却是细胞可能会当中存在颤动系统设计却是，我们推测这些氨基单糖的减低是由于糖类磷化物减低。我们推测在H1299和PC9细胞可能会当中OCR与仙人掌醛水的磷化物有关，分心NNT后OCR增加(示意图6B)。我们还通过观察到NNT却是细胞可能会当中饱和糖类和不饱和糖类均大量造就(示意图6C)。糖类氢化须要要耗用大量NADPH，而且NNT分心后NADPH的有效持续性增加，于是我们相信这些糖类素质的减低是由于除此以外源持续性糖类钙的减低。另除此以外，我们推测，NNT却是细胞可能会增极强了对荧光仙人掌醛类似物的吸收战斗能力(示意图6D)。为了评价NNT分心后糖类的造就确实是一个潜在的不利因素，我们使用饱和糖类仙人掌醛酯刺激NNT却是细胞可能会24不间断，推测NNT分心后使H1299和H2009细胞可能会对仙人掌醛水引人注意(示意图6E)。此除此以外，NNT分心后特别是在增加了H1299和PC9细胞可能会对单一不饱和糖类油醛水的引人注意持续性(示意图6F)。鉴于除此以外源持续性糖类多余的有害不良影响，我们预计细胞可能会除此以外骨骼肌耗用将保护NNT的缺少。令人惊讶的是，培养基当中的骨骼肌耗用加剧了NNT的持续上升(示意图6G)。愈来愈极其重要的是，NNT分心后细胞可能会除此以外骨骼肌缺少可能会减低NADPH的耗用(示意图6H)，这确实在发挥作用除此以外源持续性糖类的只能被逼氢化糖类，使NNT却是细胞可能会当中NADPH的有效持续性增加。总的来说，这些统计数据确实NNT也许在平衡糖类人体内当中起极其重要更为重要作用，NSCLC细胞可能会的糖类人体内紊乱也许是一个可依靠的却是。

7 NNT缺少后真核细胞可能会类似物过磷化物氢酵素(MitoCatalase)扭转Fe-S蛋白质机能

Fe-S蛋白质对分子磷和愈来愈多有害物质的磷化物极为引人注意。虽然我们未通过观察到真核细胞可能会蛋白质抗菌系统设计的磷化物长时间愈演愈烈推移，但这这不无关NNT分心后引发的真核细胞可能会ROS所须要将这些引人注意持续性辅因子磷化物。为了探寻这种也许持续性，我们使用了真核细胞可能会类似物的过磷化物氢酵素(MitoCatalase)来增极强真核细胞可能会的抗菌战斗能力。我们成功地在H1299、H2009和PC9细胞可能会当中过表达显露来了MitoCatalase (示意图7A)。MitoCatalase的表达显露来也一小弱化了NNT分心后就其真核细胞可能会当中H2O2的导致(示意图7B)。这与NNT分心后颤动碱基复杂大型活动的减低相对于应将(示意图7C和7D)。另除此以外，MitoCatalase的表达显露来以后NNT分心后ACO2的活持续性(示意图7E)。综上所述，这些统计数据确实，增加真核细胞可能会利尿H2O2的战斗能力可以避免NNT分心后Fe-S蛋白质愈演愈烈却是，从而使NNT在避免Fe-S蛋白质愈演愈烈磷化物方面造就更为重要作用，但对Fe-S簇的生物氢化就其键作用。

结论

总之，我们的研究工作确实，NNT对肾炎生物学具有极其重要意义，主要是通过调控Fe-S蛋白质而有利于真核细胞可能会人体内。与以往评价NNT机能的研究工作相同，我们描述了NNT对NSCLC当中真核细胞可能会磷化物氢化波形的微妙不良影响。在NSCLC当中，NNT活持续性也许减低了大量磷化物人体内引致的磷化物应将激加成。我们的推测更进一步确实了真核细胞可能会人体内在肾炎愈演愈烈当中的必要持续性，指明真核细胞可能会机能的增极强也许是肾炎病人的一个极其重要途径。酵素TPH-1对肾保护起更为重要更为重要作用，也许作为病人CKD的潜在病人途径。

原始显露处：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.